Eleonora d’Este kam am 4. Juli 1515 als Tochter von Alfonso I. d'Este und seiner zweiten Frau Lucrezia Borgia in Ferrara zur Welt. Ihr Großvater mütterlicherseits war der Papst Alexander VI. (Rodrigo Borgia (1431-1503); ihr Onkel war der Renaissancefürst Cesare Borgia. Im Alter von vier Jahren verlor Eleonora ihre Mutter, und ihr Vater Alfonso heiratete seine langjährige Geliebte Laura Dianti. Eleonora trat in den Konvent von Corpus Domini ein. Nach ihrem Tod (+ 1493) wurde sie neben ihrer Mutter Lucrezia in der Klosterkirche in Ferrara in der Via Pergolato Nr. 4 beigesetzt.
Ihre Genealogie befindet sich im Stammbaum-Netzwerk und im Familienbuch Adelsgeschlechter.